Stephen A Bustin. Editor: Eleni Gavriilaki. Pruebas RT-qPCR y métricas de rendimiento en la era de la COVID-19 Int J Mol Sci. 2024; 25(17): 9326. Medical Technology Research Centre, Anglia Ruskin University, Chelmsford, UK;
Resumen
La pandemia de COVID-19 puso de relieve el papel crucial de las pruebas diagnósticas en el manejo de las enfermedades infecciosas, en particular mediante el uso de pruebas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) que ha sido fundamental para detectar y cuantificar el ARN viral, lo que ha permitido la identificación y el manejo de las infecciones por SARS-CoV-2. Sin embargo, a pesar de su uso generalizado, persiste una notable brecha en la comprensión de parámetros diagnósticos fundamentales, como la sensibilidad y la especificidad, entre muchos científicos y profesionales sanitarios. Esta brecha no es meramente académica; tiene profundas implicaciones para la interpretación de los resultados de las pruebas, la toma de decisiones de salud pública y la evolución de los pacientes. Esta revisión pretende aclarar las distinciones entre los parámetros de laboratorio y de campo en el contexto de las pruebas de RT-qPCR para el SARS-CoV-2 y resumir los esfuerzos globales que condujeron al desarrollo y la optimización de estas pruebas durante la pandemia. Su objetivo es mejorar la comprensión de estos conceptos fundamentales entre científicos y profesionales sanitarios que puedan no estar familiarizados con los matices de la evaluación de pruebas diagnósticas. Este conocimiento es crucial para interpretar con precisión los resultados de las pruebas, tomar decisiones informadas en materia de salud pública y, en última instancia, gestionar de forma más eficaz los brotes de enfermedades infecciosas.
1. Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) son posiblemente las tecnologías moleculares más importantes inventadas y han tenido un impacto crítico en la investigación biológica, médica, veterinaria y agrícola. Los ensayos basados en qPCR pueden ser cuantitativos, como suele ser el caso de las aplicaciones de investigación, o cualitativos, como suele ser el caso de las pruebas de diagnóstico. Como era de esperar, su velocidad, sensibilidad y especificidad han hecho de la qPCR y la RT-qPCR las principales herramientas de medición de diagnóstico molecular utilizadas para establecer la identidad de agentes infecciosos específicos que causan infecciones.
Aunque muy adecuados para esta tarea, los resultados basados en PCR se ven afectados, como cualquier otra herramienta, por cómo y bajo qué condiciones se aplica la tecnología. Esto se ha vuelto especialmente pertinente después del uso omnipresente de la tecnología durante la pandemia de COVID-19. Esto ha dado lugar a su aplicación y a la interpretación de sus resultados por parte de una amplia gama de usuarios y partes interesadas, muchas de las cuales desconocen sus conceptos, detalles técnicos, ventajas y limitaciones. Si bien esta revisión se centra en la detección del SARS-CoV-2, sus conceptos y conclusiones son aplicables en general a todas las pruebas de diagnóstico molecular.
Debido a que las pruebas diagnósticas RT-qPCR se utilizan de tantas maneras diferentes, en distintas condiciones, por distintos usuarios y de forma no estandarizada, la interpretación de los resultados resulta algo compleja. Si bien el ensayo RT-qPCR en sí es sencillo, el procedimiento general de la prueba implica múltiples pasos adicionales previos y posteriores que no están relacionados con la prueba en sí, pero que afectan su rendimiento aparente y la interpretación de los resultados. Cualquiera (o más) de estos pasos puede fallar y hacer que la prueba parezca menos fiable de lo que realmente es .
El proceso de prueba RT-qPCR implica las siguientes etapas:
Toma de muestras: El primer paso es recolectar una muestra de la persona que podría estar infectada con un patógeno. La forma, el lugar y la persona que la toma pueden influir enormemente en el resultado final de la prueba.
Almacenamiento, manipulación y transporte de muestras: Los diferentes hisopos, tubos y soluciones utilizados para almacenar una muestra afectan la estabilidad del virus y pueden introducir inhibidores que afecten los resultados de las pruebas. Dado que muchas muestras se procesan en sitios alejados de donde se tomaron, las condiciones de transporte al laboratorio son importantes. Además, la manipulación de la muestra durante este proceso afecta la integridad del ARN viral .
Extracción de ARN: Además de las proteínas virales y el ARN viral, la muestra de un paciente contiene una mezcla de componentes. Esto generalmente requiere un procedimiento para extraer y purificar el ARN viral. Existen diversas maneras de hacerlo, lo que aumenta las posibles inconsistencias en los resultados.
Transcripción inversa: Este paso convierte el ARN viral en una plantilla de ADN que puede ser amplificada por la Taq polimerasa. Existe una amplia gama de transcriptasas inversas, y esta elección afecta significativamente la sensibilidad de un ensayo de RT-qPCR.
Amplificación: Las propiedades de las diferentes polimerasas Taq también difieren, especialmente en cuanto a velocidad de polimerización, actividad exonucleasa, termoestabilidad, fidelidad y procesividad. Esto las convierte en la principal fuente de sesgo en los perfiles de amplificación con variabilidad adicional introducida por su preferencia por ciertos motivos de secuencias de cebadores.
Detección: El método más común para detectar productos de PCR se basa en la fluorescencia y, para fines de diagnóstico, implica el uso de una sonda específica de amplicón de PCR, generalmente una sonda de hidrólisis o una baliza molecular. Puede ser solo de ADN o tener fracciones de LNA o pentabasa, todo lo cual influye en el rendimiento de un ensayo. Por lo tanto, el número de ciclos necesarios para amplificar el ADN a un nivel detectable puede variar considerablemente entre pruebas de RT-qPCR, incluso para la misma muestra.
Diferentes pruebas de RT-qPCR pueden necesitar más o menos ciclos de amplificación para detectar la luz emitida por el producto de amplificación de RT-qPCR, y otros factores también pueden marcar la diferencia, como la cantidad inicial de virus en la muestra, las características del virus o qué termociclador se utiliza. Además, los valores del ciclo de cuantificación (Cq) no son una medida definitiva, ya que dependen del análisis de datos subjetivos y, por lo tanto, no se deben utilizar para los ajustes de corte.
Limitaciones de los valores Cq
Es importante destacar que los umbrales alterados alteran los resultados y, dado que los umbrales calculados por instrumentos de diferentes fabricantes varían dependiendo de qué pocillo o combinación de pocillos se estén analizando, los valores de Cq también difieren. Por lo tanto, un valor de Cq por sí solo nunca se debe utilizar para comparar resultados obtenidos con las mismas muestras o con diferentes muestras en diferentes momentos en diferentes instrumentos utilizando diferentes pruebas o reactivos.
En consecuencia, en términos del uso práctico de una prueba, un valor de corte arbitrario de Cq para etiquetar un virus objetivo como presente o ausente en una muestra no es confiable y solo se debe utilizar, y luego con precaución, si los puntos de corte se han normalizado con enfoques de cuantificación relativa o absoluta. Esta es una razón por la que muchas pruebas de diagnóstico son cualitativas, es decir, registran solo un resultado presente/ausente........
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Dr. Anibal E. Bagnarelli,
Bioquímico-Farmacéutico,UBA.
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