Tirsa T. van Duijl, L. Renee Ruhaak, Nico P. M. Smit, Mervin M. Pieterse, Fred P. Romijn, Natasja Dolezal, Jan Wouter Drijfhout, Johan W. de Fijter, Christa M. Cobbaert. Desarrollo y validación provisional de una prueba multiplex LC-MRM-MS en orina para la detección oportuna de daño renal. J Proteome Res. 2021; 20(12): 5304–5314. Department of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands.
Resumen
La lesión renal es una complicación frecuente en pacientes hospitalizados. La detección temprana de la lesión renal antes de la pérdida de la función renal es una necesidad clínica insatisfecha que debe ser objeto de un panel de biomarcadores basados en proteínas. En este estudio, nuestro objetivo es cuantificar los biomarcadores de lesión renal urinaria en el nivel picomolar a nanomolar mediante "cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem en modo de monitoreo de reacción múltiple" (LC-MRM-MS). Las proteínas se inmuno-capturan en muestras de orina, se desnaturalizan, se redujeron, alquilaron y digirieron en péptidos, antes del análisis LC-MRM-MS. Los péptidos marcados con isótopos estables funcionan como estándares internos y las concentraciones de biomarcadores se alcanzaron mediante una estrategia de calibración externa. Se evaluó el método en cuanto a selectividad, arrastre, efectos de matriz, linealidad e imprecisión. El método LC-MRM-MS permitió la cuantificación de los siguientes marcadores: KIM-1, NGAL, TIMP2, IGFBP7, CXCL9, nephrin y SLC22A2 y la detección de TGF-β1 cubilin y uromodulin. Se incluyeron de dos a tres péptidos por proteína, y se monitorearon tres transiciones por péptido para la selectividad analítica. El arrastre analítico fue <1 % y se observaron efectos mínimos en la matriz de la orina al combinar la inmuno-captura y el análisis LC-MRM-MS específico. El CV total medio de todos los péptidos cuantificadores fue del 26 %. El rango de medición lineal se determinó por mensurando y se encontró que era de 0,05 a 30 nmol/L. El método específico basado en MS permite la cuantificación multiplex de biomarcadores de lesión renal urinaria de baja concentración para futuras evaluaciones clínicas.
Introducción
La ocurrencia de lesión renal contribuye significativamente a la morbilidad y mortalidad de los pacientes hospitalizados. La lesión renal aguda (LRA) es un síndrome clínico definido por el aumento de creatinina sérica y reducción de la diuresis. Debido a la respuesta retardada de la creatinina sérica, la lesión renal temprana suele pasar desapercibida hasta que se produce una disminución significativa de la función renal.
Además, los médicos actualmente carecen de herramientas diagnósticas no invasivas frecuentes para diferenciar la lesión renal aguda con una causa prerrenal a menudo transitoria del daño renal intrínseco, como la necrosis tubular aguda ya establecida.
La detección temprana y específica de la lesión renal, antes de la disminución de la función renal basada en la creatinina sérica, se identificó como una necesidad clínica no satisfecha en la atención de rutina del paciente a través de un cuestionario desarrollado por la European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM).
Para abordar esta necesidad clínica, definimos un panel de biomarcadores basados en proteínas que incluye los marcadores de lesiones tempranas molécula de lesión renal 1 (KIM-1), proteína asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), inhibidor tisular de metaloproteinasas 2 (TIMP2), proteína de unión al factor de crecimiento de insulina (IGFBP7), ligando de quimiocinas inflamatorias 9 (CXCL9) y marcador de fibrosis factor de crecimiento transformante β-1 (TGF-β1, sin péptido asociado a latencia, LAP), y proteínas enriquecidas en tejido renal nefrina, miembro 2 de la familia de transportadores de solutos 22 (SLC22A2), uromodulina y cubilina,
Actualmente, no se dispone de una prueba multiplex para la cuantificación de estas proteínas en muestras de orina. Por lo tanto se propone una combinación de marcadores biológicos que en lesiones tempranas podría detectar la lesión renal y obtener información sobre el sitio más probable de la lesión.
La cuantificación de proteínas de matrices biológicas complejas en el laboratorio de bioquímica clínica generalmente se realiza a través de inmunoensayos o pruebas basadas en espectrometría de masas (MS). En la proteómica ascendente cuantitativa basada en MS, las proteínas se digieren enzimáticamente en péptidos, que se cuantifican para representar la concentración de proteína original. Las muestras de orina son muy variables en composición y concentración; en particular, la proteinuria y la hematuria pueden dificultar la cuantificación de proteínas. Se ha demostrado que la combinación de inmunocaptura de proteínas diana y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem en modo de monitorización de reacciones múltiples (LC-MRM-MS) permite la cuantificación sólida de proteínas de baja concentracion por debajo de 1 nmol/L. A través de la selección de múltiples péptidos proteotípicos por proteína y múltiples transiciones de masa por péptido, se puede lograr una alta selectividad biológica y analítica......
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Cordiales saludos.
Dr. Anibal E. Bagnarelli,
Bioquímico-Farmacéutico-UBA.
Ciudad de Buenos Aires. R. Argentina
