Correspondencia al Editor: Robert D.H. Markewitz, Klaus-Peter Wandinger, Ralf Junker..Saliva para la detección de SARS-CoV-2. New Englang J Medicines February 3, 2021. University Hospital Schleswig-Holstein, Kiel, Germany.
Wyllie y sus colegas (edición del 24 de septiembre) proporcionan datos útiles sobre el uso de muestras de saliva para la detección del SARS-CoV-2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Nos gustaría llamar la atención sobre un detalle. Para la mayoría de los datos de la PCR se aplicó cuantificación absoluta, que proporcionó datos sobre la carga viral de las muestras en unidades de copias por mililitro. Wyllie y col. lo hizo utilizando una fórmula que se basaba en una curva estándar que se generó midiendo diluciones en serie de cantidades conocidas de transcripciones de ARN del SARS-CoV-2, que se realizó durante un estudio anterior. Para obtener resultados fiables en la PCR cuantitativa (qPCR), los estándares se amplifican generalmente en paralelo con las muestras durante cada prueba de PCR individual, lo que genera una nueva curva estándar para cada ejecución de prueba.
En nuestra opinión, podría ser engañoso calcular los resultados de qPCR de diferentes experimentos con el uso de la misma curva estándar. Antes de que las preparaciones biológicas de referencia confiables para el ARN del SARS-CoV-2 estén ampliamente disponibles, los resultados de qPCR para el SARS-CoV-2 deben interpretarse con precaución, porque implican una comparabilidad que no se da necesariamente si cada prueba de PCR no se realiza de acuerdo con a estándares de cantidad y calidad conocidas. Los valores de umbral de ciclo (Ct) que carecen de referencia a una curva estándar no pueden interpretarse como valores cuantitativos en absoluto.
Respuesta de los Autores : Anne L. Wyllie, Chantal B.F. Vogels, Nathan D. Grubaugh, Yale School of Public Health, New Haven, CT
Markewitz y sus colegas plantean un punto importante que no dejamos lo suficientemente claro en la sección Métodos de nuestro artículo. Aunque estamos de acuerdo en que la variación entre diferentes series de pruebas de PCR puede dar lugar a diferencias en los valores absolutos de Ct, controlamos esto. La fórmula para cuantificar las copias de ARN del SARS-CoV-2 se calculó a partir de una curva estándar para la detección del SARS-CoV-2 con el uso de nuestro ensayo RT-qPCR, y se aplicó el mismo enfoque en todas las pruebas de muestras nasofaríngeas y de saliva. En cada placa de PCR, incluimos un control de 1000 copias de ARN por microlitro, por duplicado, para controlar la amplificación relativa entre placas. Consideramos que las placas de PCR eran válidas para la cuantificación si los controles estaban dentro de 2 Ct de los valores obtenidos de la dilución estándar completa. Este es un enfoque común para monitorear la variación entre placas mientras aumenta el rendimiento de las pruebas de muestras. Observamos que las muestras pareadas de nasofaringe y saliva que se obtuvieron del mismo participante individual en el mismo momento se analizaron en la misma serie. Por lo tanto, creemos que las discrepancias entre las cuantificaciones de virus son menores y no afectan nuestras conclusiones.
