Jordi Farré-Segura, Caroline Le Goff, Pierre Lukas, Gaël Cobraiville, Marianne Fillet, Anne-Catherine Servais, Pierre Delanaye, Etienne Cavalier. Validación de un método LC-MS/MS mediante extracción en fase sólida para la cuantificación de la hormona paratiroidea 1-84: candidato hacia un procedimiento de medición de referencia. Oxford Academic-Clin Chem 2022; 68 (11): 1399–1409. Department of Clinical Chemistry, University of Liège (ULiège), Liège, Belgium
Resumen
Antecedentes: La medición de la hormona paratiroidea (PTH) es importante para los pacientes con trastornos del metabolismo del calcio, incluidos aquellos que necesitan un control del recambio óseo debido a una enfermedad renal crónica o un trastorno óseo mineral. Actualmente hay 2 generaciones de inmunoensayos de PTH en el mercado, ambos con problemas de reactividad cruzada y sin estandarización. Por lo tanto, desarrollamos un método de orden superior LC-MS/MS para el análisis de PTH.
Métodos: El método fue calibrado contra el estándar internacional para 1-84 PTH (WHO 95/646). La preparación de muestras sin anticuerpos con la adición de un estándar interno marcado con isótopos se realizó mediante extracción en fase sólida. Los extractos se analizaron por LC-MS/MS. Se utilizó plasma EDTA-K 2 durante todo el desarrollo y su validación. Las fuentes de sesgo e incertidumbre se probaron de acuerdo con la norma ISO 15193. Se consultaron las directrices del Clinical Laboratory Standards Institute y los procedimientos de medición de referencia para el diseño de la validación. Se compararon muestras de pacientes y controles de calidad externos entre LC-MS/MS y 2 inmunoensayos de tercera generación.
Resultados: El método fue validado para 1-84 PTH de 5,7 a 872,6 pg/mL. La imprecisión entre ensayos estuvo entre el 1,2 % y el 3,9 %, y la precisión osciló entre el 96,2 % y el 103,2 %. La incertidumbre de medida fue < 5,6%. La comparación entre LC-MS/MS y los inmunoensayos mostró un sesgo proporcional pero una correlación de moderada a sustancial entre los métodos.
Conclusiones: Este método LC-MS/MS, que es independiente de anticuerpos, es adecuado para una amplia gama de concentraciones de PTH. Las especificaciones de rendimiento analítico obtenidas demuestran que el desarrollo de un procedimiento de medición de referencia será posible una vez que esté disponible un patrón de referencia de orden superior.
Introducción
La hormona paratiroidea (PTH) es un péptido de 84 aminoácidos de cadena única producido por las glándulas paratiroides y liberado a la circulación cuando disminuye la concentración de calcio ionizado en plasma. La PTH se une a las células óseas y renales que expresan el receptor peptídico relacionado con la PTH/hormona paratiroidea tipo 1 para ejercer su actividad biológica. En el riñón, la PTH estimula la reabsorción de calcio, estimula la actividad de la 1-alfa hidroxilasa para producir 1,25 dihidroxivitamina D y disminuye la reabsorción de fosfato. La PTH controla la remodelación ósea y la homeostasis del calcio y el fosfato al actuar sobre condrocitos, osteoprogenitores, osteoblastos y osteocitos.
Una vez en circulación, la vida media de 1-84 PTH es de 2 a 4 min, y el péptido se metaboliza en el hígado. Esta vía conduce a la producción de formas truncadas, como fragmentos de PTH truncados en la mitad o C-terminales grandes. Cabe destacar que tales fragmentos también son secretados por las glándulas paratiroides. Estos fragmentos tienen una vida media más larga que la propia PTH 1-84 y representan aproximadamente del 15% al 30% de la PTH total en individuos sanos. Dado que estos fragmentos son eliminados por los riñones, se acumulan en la sangre de los pacientes que padecen enfermedad renal crónica (ERC), y pueden representar hasta un 70% a 80% de la PTH total.
En la práctica diaria, la PTH se mide para el diagnóstico de hiperparatiroidismo primario y secundario. También se mide en pacientes con ERC y pacientes sometidos a hemodiálisis (DIA) para el tratamiento de la ERC: trastorno mineral óseo, una complicación frecuente de la enfermedad renal avanzada que conduce a enfermedades óseas de alto o bajo recambio y/o enfermedades vasculares o de tejidos blandos. calcificación.
Esta medición se logra a través de inmunoensayos utilizando un par de anticuerpos dirigidos contra las partes C- y N-terminal del péptido. Dos generaciones de inmunoensayos están actualmente presentes en el mercado. Los ensayos de PTH intacta (o de segunda generación) se han utilizado desde 1987. En estos ensayos, un anticuerpo N-terminal se dirige contra la parte 13-24 N-terminal del péptido (excepto el ensayo de PTH intacta de Roche en el que el anticuerpo N-terminal reconoce un epítopo ubicado más lejos del N-terminal). Además de la propia PTH 1-84, se ha demostrado que estos ensayos reconocen una familia de fragmentos C-terminales grandes denominados PTH no (1-84), lo que explica su sobrestimación de la PTH en el contexto de la hiperparatiroidismo.
En 1999 aparecieron en el mercado los inmunoensayos de tercera generación (también llamados ensayos de PTH entera o bioactiva). Los ensayos de tercera generación tienen el anticuerpo N-terminal dirigido hacia los primeros 4 aminoácidos del péptido y se presentan como altamente específicos para el péptido 1-84 debido a su ausencia de reactividad cruzada con la PTH no (1-84). También se ha informado que ambas generaciones de ensayos reaccionan de forma cruzada con la PTH oxidada, una variante modificada postraduccional supuestamente producida en pacientes sometidos a un fuerte estrés oxidativo, como los pacientes con DIA.
Los ensayos de PTH de tercera generación también reaccionan de forma cruzada con otra variante de modificación postraduccional llamada amino-PTH, una forma de PTH no truncada, que se produce en exceso en el carcinoma de paratiroides y tipos graves de hiperplasia paratiroidea en pacientes sometidos a DIA. Las discrepancias entre los diferentes ensayos de PTH pueden explicarse en parte por las diferentes reactividades cruzadas antes mencionadas, especialmente en pacientes en los que tienden a acumularse formas modificadas de PTH......
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Dr. Anibal E. Bagnarelli,
Bioquímico-Farmacéutico-UBA.
Ciudad de Buenos Aires. R. Argentina
