Lauren M Wainman , Shivaprasad H Sathyanarayana , Joel A Lefferts . Aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) en pruebas moleculares y clínicas. The Journal of Applied Laboratory Medicine, 2024; 9 (1): 124–137. Laboratory for Clinical Genomics and Advanced Technology (CGAT), Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock. Medical Center, Geisel School of Medicine at Dartmouth, Lebanon, NH, United States
Resumen
Antecedentes: La reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) es un método molecular preciso y sensible que se puede utilizar en pruebas clínicas de diagnóstico, pronóstico y predicción. El componente clave del método dPCR es la división de una única reacción en miles de gotas, nanocanales u otras reacciones de tamaño nanométrico o picolítrico. Esto da como resultado una sensibilidad suficientemente alta para detectar dianas de ácidos nucleicos poco frecuentes y proporciona una cuantificación absoluta de secuencias o alelos diana en comparación con otros métodos basados en PCR.
Contenido: En los últimos años se ha introducido comercialmente un número creciente de plataformas de dPCR, y se están desarrollando más. Estas plataformas difieren en el método de partición, el grado de automatización y las capacidades de multiplexación, pero todas pueden utilizarse de forma similar para la cuantificación sensible y de alta precisión de diversos ácidos nucleicos. Actualmente, las aplicaciones clínicas de la dPCR incluyen oncología, microbiología y enfermedades infecciosas, genética y cribado prenatal/neonatal. Se están desarrollando pruebas comerciales para aplicaciones clínicas que detectan variantes con relevancia diagnóstica, pronóstica y terapéutica en tipos específicos de enfermedades.
Conclusion: La potencia de la tecnología dPCR reside en la separación de las reacciones, lo que se traduce en una mayor sensibilidad y precisión en comparación con la qPCR. Más recientemente, la sensibilidad de la dPCR se ha aplicado a la detección de variantes conocidas en ADN libre circulante y ADN tumoral circulante. Entre las futuras aplicaciones clínicas de la dPCR se incluyen la biopsia líquida, la detección de resistencia al tratamiento, la detección de enfermedad residual mínima y el seguimiento del injerto en pacientes trasplantados.
Introducciòn
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método sensible y específico para la amplificación in vitro de secuencias de ácidos nucleicos que ha ganado mayor atención y reconocimiento por parte del público general en los últimos años debido a la pandemia de COVID-19. Mediante el uso de cebadores de oligodesoxinucleótidos específicos, la PCR puede identificar una secuencia diana y luego se utiliza una ADN polimerasa para amplificar millones de copias (amplicones) de la secuencia diana. En el momento en que los laboratorios clínicos comprendieron el potencial de esta técnica, rápidamente se convirtió en la base de numerosas aplicaciones en pruebas clínicas. Desde entonces, los avances relacionados con la técnica de PCR y las nuevas formas de instrumentación se han combinado para mejorar la tecnología, que ha evolucionado hasta convertirse en un método fiable, asequible y fácil de usar que se realiza en laboratorios de investigación y clínicos en todo el mundo.
Con el tiempo, la PCR ha evolucionado, dando lugar a 3 “generaciones”. La versión original de la PCR, la primera generación, también se conoce como PCR de punto final, ya que el análisis solo es posible una vez completado el ciclo de PCR. Durante la PCR, la secuencia diana se duplica en cada ciclo y, posteriormente, se pueden utilizar diversos métodos post-PCR, como la electroforesis en gel de agarosa, para la detección y el análisis cualitativos de la secuencia de ADN. Sin embargo, la primera generación de PCR está limitada por la falta de resultados cuantitativos y el tiempo laborioso que requiere tanto para la preparación de la PCR como para el análisis post-PCR.
La segunda generación de PCR, denominada PCR cuantitativa o en tiempo real (qPCR), puede detectar la secuencia diana en tiempo real mediante señales fluorescentes que se liberan proporcionalmente a la cantidad de ADN diana inicial. Esto requiere la prueba de calibradores para crear curvas estándar/de calibración, las cuales pueden verse afectadas por sustancias interferentes que pueden producir resultados cuantitativos inexactos.
La tercera generación es la PCR digital (dPCR), que permite la cuantificación absoluta mediante la partición de la PCR. En la dPCR, una única reacción se divide en miles de PCR individuales, de manera que cada partición se evalúa individualmente para determinar si el resultado de la amplificación es positivo o negativo. Esta evaluación digital permite una cuantificación más precisa que no requiere curvas de calibración y es menos susceptible a los efectos de sustancias interferentes (inhibidores de la PCR). La dPCR es altamente sensible y precisa para diversas aplicaciones moleculares clínicas, incluyendo la detección de alelos raros y el análisis del número de copias.
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Nueva presentación el 03 de Noviembre .
Dr. Anibal E. Bagnarelli,
Bioquímico-Farmacéutico,UBA.
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