Shengyun Liao, Lingli Wang, Xiang Ji, Qiang Li, Lan Ma. Detección simultánea de 15 patógenos respiratorios con un prueba de PCR multiplex en tiempo real, basado en análisis de curvas de fusión de sonda de fluorescencia. Int J Mol Epidemiol Genet. 2019; 10(2): 29–37. Shenzhen Yilifang Biotech Co. Ltd, Shenzhen , China,
Resumen
Las infecciones agudas del tracto respiratorio son comunes en todo el mundo y son causadas por una gran diversidad de patógenos. Un método de diagnóstico rápido y preciso de infección respiratoria es crucial para una intervención clínica oportuna. Aquí, al combinar el análisis de curva de fusión de fluorescencia y el análisis multiplex en tiempo real, desarrollamos un método novedoso que puede detectar simultáneamente 15 virus respiratorios. La especificidad para los genes diana fue del 100%, según se evaluó con un panel de 47 agentes patógenos respiratorios, que no indicaron reacciones cruzadas. Los límites de detección del ensayo a nivel de ácido nucleico variaron de 5 a 500 copias/μL de ácidos nucleicos. En comparación con el método de cultivo convencional, en 384 muestras clinicas nuestro ensayo mostró más del 75% de sensibilidad y 100% de especificidad para cada patógeno respiratorio . Aún más, la correlación kappa para todos los patógenos varió de 0.86 a 1.00. En general, este método tiene características de alto rendimiento, bajo costo y alta sensibilidad y precisión, lo que demostró que es muy adecuado para pruebas clínicas de rutina en infecciones respiratorias.
Introducción
Las infecciones agudas del tracto respiratorio son la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, especialmente en lactantes y niños pequeños. Los patógenos causan infecciones respiratorias agudas que son muy variables, incluyendo predominantemente 26 virus identificados hasta ahora, así como hongos y bacterias filogenéticamente diversas, como bacterias Gram negativas (por ejemplo, estreptococos), Clamidia-especies y micoplasma. Los síntomas clínicos similares de las infecciones respiratorias causadas por diversos agentes patógenos dificultan el diagnóstico diferencial basado en parámetros clínicos. Por lo tanto, la detección rápida y precisa de patógenos respiratorios es importante para el manejo clínico oportuno, la reducción del abuso inadecuado de antibióticos y la prevención de brotes y epidemias.
Los avances en biología molecular han mejorado dramáticamente la detección clínica de patógenos. En particular, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR de transcripción inversa ahora se usan ampliamente para detectar virus respiratorios, exhibiendo una sensibilidad superior para la detección de virus respiratorios sobre los métodos más convencionales de cultivo de virus y pruebas rápidas de detección directa de antígeno. El desarrollo de la tecnología de PCR multiplex a partir de técnicas de PCR convencionales anteriores ha permitido la detección simultánea de múltiples patógenos respiratorios de una sola muestra de paciente, lo que ahorra tiempo, esfuerzo y costos. En los últimos años, han surgido una variedad de nuevas técnicas de PCR multiplex basadas en la PCR multiplex común, incluida la tecnología de oligonucleótidos de cebado dual, la amplificación de sonda dependiente de la ligadura multiplex y una técnica de extensión específica del objetivo, que combina PCR multiplex con tecnología de chip de fase líquida.
La mejora de varios aspectos de las condiciones comunes de PCR en estas tecnologías ha permitido lograr una detección de alto rendimiento con alta sensibilidad y especificidad. Aunque el uso de estas tecnologías tiene las ventajas de aumentar la sensibilidad de detección y la automatización, están asociadas con un mayor número de pasos operativos junto con un mayor tiempo operativo, riesgo de contaminación y costo.
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT) ha sido el estándar de oro para analizar genes relacionados con enfermedades durante décadas. Los métodos actuales de RT-PCR permiten la detección simultánea de solo dos o tres patógenos en una sola reacción debido a la capacidad discriminatoria limitada de los instrumentos. El análisis de curva de fusión de fluorescencia basado en sonda multicolor se desarrolló para superar estas limitaciones........
La mejora de varios aspectos de las condiciones comunes de PCR en estas tecnologías ha permitido lograr una detección de alto rendimiento con alta sensibilidad y especificidad. Aunque el uso de estas tecnologías tiene las ventajas de aumentar la sensibilidad de detección y la automatización, están asociadas con un mayor número de pasos operativos junto con un mayor tiempo operativo, riesgo de contaminación y costo.
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT) ha sido el estándar de oro para analizar genes relacionados con enfermedades durante décadas. Los métodos actuales de RT-PCR permiten la detección simultánea de solo dos o tres patógenos en una sola reacción debido a la capacidad discriminatoria limitada de los instrumentos. El análisis de curva de fusión de fluorescencia basado en sonda multicolor se desarrolló para superar estas limitaciones........
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Dr. Anibal E. Bagnarelli, Bioquímico-Farmacéutico-UBA.
Ciudad de Buenos Aires, Argentina
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