Jonathan R Brestoff. Citometría de flujo de espectro completo en el laboratorio clínico. Wiley- Int J Lab Hematol. 2023;45 (Suppl 2):44–49. Division of Laboratory and Genomic Medicine, Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, Saint Louis, USA.
Resumen
La citometría de flujo de espectro completo o “espectral” es una tecnología desarrollada recientemente que permite realizar análisis citométricos de flujo de alta dimensión de células y partículas en suspensión. Esta tecnología de células individuales ha ganado popularidad en entornos de investigación porque puede detectar de manera conservadora 35 o más antígenos simultáneamente en un formato de ensayo de un solo tubo. Recientemente, la citometría de flujo espectral ha obtenido la aprobación regulatoria para su uso como dispositivo de diagnóstico in vitro en China y Europa, lo que permite el uso de esta tecnología en algunos laboratorios clinicos con citometría de flujo. El propósito de esta revisión es describir los principios básicos de la citometría de flujo convencional y espectral, contrastando estas dos tecnologías. Para ilustrar el poder analítico de la citometría de flujo espectral, proporcionamos un ejemplo de análisis de datos de citometría de flujo espectral y el uso de un algoritmo de aprendizaje automático para recopilar la gran cantidad de información contenida en grandes conjuntos de datos de citometría de flujo espectral. Finalmente, analizamos las ventajas de la adopción de la citometría de flujo espectral en laboratorios clínicos y estudios preliminares que comparan el rendimiento de esta tecnología en relación con los citómetros de flujo convencionales que se utilizan actualmente en entornos de laboratorios clínicos.
1-Introdución
La citometría de flujo es una tecnología poderosa que se utiliza para analizar y medir las características físicas, químicas y/o de expresión genética de células o partículas. Esta técnica permite a los laboratorios clínicos y a los investigadores medir numerosas propiedades de células individuales de una manera rápida, multiplexada y cuantitativa. Dada la alta flexibilidad de la citometría de flujo, esta tecnología ha ganado una amplia adopción en numerosos campos científicos, incluidos la inmunología, la biología celular, la investigación del cáncer, la biología del desarrollo y muchos otros.
En el entorno del laboratorio clínico, la citometría de flujo se utiliza con mayor frecuencia para respaldar el diagnóstico de inmunodeficiencias primarias, secundarias y neoplasias hematológicas, para monitorear las respuestas a la terapia y poder detectar la progresión o recurrencia de la enfermedad.
Esta tecnología también se utiliza para respaldar las terapias celulares, incluida una enumeración de células madre para el almacenamiento y la implementación en el contexto de trasplantes de células madre y la fabricación de células modificadas genéticamente, como las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR).
Aunque los citómetros de flujo convencionales se han utilizado en los laboratorios clínicos durante décadas, otra tecnología interesante llamada citometría de flujo de espectro completo (denominada en este documento citometría de flujo espectral) ha ganado una atracción y popularidad significativas en los entornos de investigación en los últimos años y recién está comenzando a usarse en laboratorios clínicos en algunos países (Europa: CE-IVD NL-CA-002-2020-53 432 y China: Su Xie Zhu Zhun 20 212 220 585).
La principal ventaja de la citometría de flujo espectral es que permite medir fácilmente más de 35 antígenos por célula en un formato de ensayo de un solo tubo. Esta revisión educativa primero describe los principios básicos de la citometría de flujo convencional y espectral y contrasta estas dos tecnologías. Se describe un ejemplo de análisis de datos de citometría de flujo espectral, destacando cómo se pueden usar los algoritmos de aprendizaje automático para recolectar la gran cantidad de información contenida en grandes ensayos basados en citometría de flujo espectral. Se discuten las ventajas y desventajas de adoptar la citometría de flujo espectral en la práctica clínica y, finalmente, se revisa el estado actual de la implementación clínica y la validación de la citometría de flujo espectral.
2 - Principios básicos e la citometría de flujo convencional y espectral
El principio más básico de todas las tecnologías de citometría de flujo es pasar una corriente de células o partículas en suspensión a través de un haz láser para medir las características físicas (es decir, ópticas) y químicas (por ejemplo, expresión de antígenos) de cada célula o partícula. A medida que las células pasan a través de la luz láser, absorben, refractan (es decir, dispersan) y emiten luz que posteriormente es capturada por una serie de detectores. La cantidad de luz que cada célula dispersa en la dirección hacia adelante es una función de su tamaño e índice de refracción. Además, cada célula tiene orgánulos, gránulos y otras características que difractan la luz hacia un lado. Esta denominada dispersión lateral (SCC) es un indicador de la complejidad general de la célula.
Dado que algunos tipos de células tienen tamaños y complejidades únicos, (FSC y SSC) es posible identificar algunos tipos de células basándose únicamente en sus propiedades, como se hace en hemogramas completos para identificar glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas (PLT) y para diferenciar linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y algunos otros tipos de células. Sin embargo, existen numerosos subconjuntos de linfocitos, por ejemplo, células T CD4 + , células T CD8 +, células T γδ, células B y células asesinas naturales (NK)) que tienen propiedades FSC y SSC muy similares, lo que hace imposible identificarlos de manera confiable sin información adicional sobre qué antígenos proteicos expresan.
El valor principal de la citometría de flujo es que permite medir la expresión de proteínas específicas de cada tipo de célula para identificar y cuantificar la abundancia o los estados de activación de subconjuntos específicos de células inmunitarias. Esto se logra uniendo una variedad de fluoróforos distintos a anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos proteicos específicos de cada tipo de célula. La luz láser excita estos fluoróforos, que luego emiten luz en diferentes longitudes de onda para su posterior detección.
Por ejemplo, CD4-PE y CD8-PE/Cy5 son excitados por el láser amarillo-verde (561 nm), pero tienen espectros de emisión que alcanzan un pico a 576 y 665 nm, respectivamente, lo que permite detectar estos dos fluoróforos al mismo tiempo para medir la cantidad de CD4 y CD8 en cada célula. Sin embargo, surgen dos problemas:
En primer lugar, los espectros de emisión de estos y otros fluoróforos pueden superponerse considerablemente, de modo que parte de la luz emitida por un fluoróforo se derrama en detectores asignados a otros fluoróforos.
En segundo lugar, los fluoróforos a menudo pueden ser excitados por más de un láser (por ejemplo, el láser azul de 488 nm también excita el PE y el PE/Cy5).
Es decir que estos inconvenientes crean un problema llamado “superposición espectral”.......
(*) Este blog de bioquímica-clínica está destinado a bioquímicos y médicos; la información que contiene es de actualización y queda a criterio y responsabilidad de los mencionados profesionales, el uso que le den a la misma.
Nueva presentación el 10 Enero 2025
Cordiales saludos.
Dr. Anibal E. Bagnarelli,
Bioquímico-Farmacéutico,UBA.
Ciudad de Buenos Aires, R. Argentina
