Mahdis Aghazadeh, Meghan Jones et.al. Aplicación de la 3base™ Technology para el diagnóstico de ocho de las infecciones protozoarias gastrointestinales más importantes desde el punto de vista clínico. MDPI- Int J Mol Sci. 2023; 24 (17):13387. Genetic Signatures, Newtown, Australia;
Resumen Chat Claude 5.0
Este artículo describe EP005 , un nuevo kit de PCR en tiempo real multiplex (mRT-PCR) que detecta los ocho parásitos protozoarios gastrointestinales más importantes desde el punto de vista clínico en una sola prueba: Cryptosporidium spp., Giardia intestinalis , Entamoeba histolytica , Dientamoeba fragilis , Blastocystis hominis , Cyclospora cayetanensis y los microsporidios Enterocytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestinalis .
La tecnología: EP005 se basa en el método patentado 3base™ , que convierte químicamente las bases de citosina en timina antes de la PCR. Esto reduce la complejidad de la secuencia (a solo tres bases: A, T, G), lo que normaliza las temperaturas de fusión de los cebadores y las sondas en organismos objetivo muy diferentes, reduciendo una dispersión de 11,4 °C a solo 1,2 °C para los cebadores. Esto permite que los ocho objetivos se ejecuten de manera eficiente en la misma reacción multiplexada, algo con lo que la química convencional de cebadores de 4 bases tiene dificultades, especialmente para organismos ricos en GC como Giardia .
Principales conclusiones:
- Sensibilidad analítica (límite inferior de detección): varía ampliamente según el objetivo, desde tan solo 4 organismos/mL para E. bieneusi hasta 5700 equivalentes genómicos/mL para G. intestinalis .
- Especificidad: no se observó reactividad cruzada al realizar las pruebas frente a otros 82 organismos que se encuentran comúnmente en el intestino.
- Validación clínica: En 380 muestras clínicas de heces, comparadas con el panel de parásitos entéricos BD MAX™ y otros métodos de PCR/secuenciación confirmatorios, todos los objetivos mostraron al menos un 90 % de concordancia. Para los tres objetivos compartidos con BD MAX™, la sensibilidad/especificidad fue alta (por ejemplo, 100 % de sensibilidad y 99,7 % de especificidad para Cryptosporidium ; 95,45 % de sensibilidad y 100 % de especificidad para G. intestinalis ; 100 %/100 % para E. histolytica ).
Cabe destacar que alrededor del 3% de las muestras presentaban infecciones mixtas, con dos o más parásitos detectados simultáneamente, lo que subraya la utilidad de un enfoque multiplex.
Funcionamiento de la química de 3base™
El método se basa en la desaminación de la citosina mediada por bisulfito , una reacción descrita por primera vez por Hayatsu en 1970. Ocurre en tres pasos:
- Sulfonación : la citosina reacciona con el bisulfito para formar sulfonato de citosina.
- Desaminación : el sulfonato de citosina se convierte en un intermediario de sulfonato de uracilo.
- Desulfonación : se elimina el grupo sulfato (tradicionalmente mediante un álcali fuerte), dejando uracilo.
Dado que el uracilo se aparea y amplifica como la timina en la PCR, el efecto neto es que cada citosina (C) de la muestra se convierte funcionalmente en una timina (T) en la cadena codificante. La adenina y la guanina permanecen inalteradas. El resultado: las secuencias genómicas que antes contenían cuatro bases posibles ahora solo varían en tres (A, T, G), de ahí el término "3base".
Por qué esto ayuda a la PCR multiplex
* El problema principal en los ensayos multiplexados es que los diferentes organismos objetivo tienen un contenido de GC muy diferente, lo que hace que sus cebadores y sondas tengan temperaturas de fusión (Tm) muy diferentes. Las amplias variaciones de Tm significan que algunos objetivos se amplifican de manera eficiente mientras que otros tienen un rendimiento inferior o fallan bajo las mismas condiciones de ciclo térmico compartidas, un problema particular para organismos ricos en GC como Giardia intestinalis .
* La desventaja inherente a este método es la pérdida de cierta información de secuencia (ya que la C y la T se vuelven indistinguibles), pero para fines de detección/diagnóstico, donde el objetivo es discriminar entre un panel fijo de objetivos conocidos en lugar de la secuenciación de novo, esta simplificación supone una ganancia neta en la eficiencia de la multiplexación......
(*) Una vez que esta en la pagina del articulo, pulsando el botón derecho puede acceder a su traducción al idioma español Este blog de bioquímica-clínica está destinado a bioquímicos y médicos; la información que contiene es de actualización y queda a criterio y responsabilidad de los mencionados profesionales, el uso que le den a la misma.
Nueva presentación el 24 de Julio
Dr. Anibal E. Bagnarelli,
Bioquímico-Farmacéutico,UBA.
Cordiales saludos.
Ciudad de Buenos Aires. R. Argentina
