Parra M D., Martínez-Subiela S., Cerón J. J. Fluorometría en Tiempo Retardado: conceptos generales y aplicaciones en medicina veterinaria. An. Vet. (Murcia) 2004; 20: 35-47
Resumen
La fluorometría en tiempo retardado es una tecnología novedosa que surge con la intención de reemplazar al radioinmunoanálisis y se presenta como una posible alternativa al ELISA. Este sistema de detección ha permitido el desarrollo de inmunoensayos altamente sensibles en los que antígenos o anticuerpos son marcados con quelatos de lantánidos, emisores de fluorescencia susceptible de ser cuantificada. Su gran sensibilidad hace que sea una herramienta eficaz en el análisis de compuestos que se encuentran en pequeñas concentraciones en diferentes fluidos orgánicos, tales como orina, sangre o saliva. Los crecientes avances en esta metodología han proporcionado ensayos ultrarrápidos y ultrasensibles para la determinación de proteínas de fase aguda y marcadores de infarto de miocardio en medicina humana, mientras que en medicina veterinaria una de sus principales aplicaciones se centra en la determinación de hormonas
1- Introducción
El comienzo del empleo de la fluorescencia en inmunología data de 1941 cuando Coons y colaboradores marcaron por primera vez anticuerpos con compuestos fluorescentes para visualizar antígenos. A partir de los años ochenta, la determinación fluorométrica con sus aplicaciones en fluoroinmunoensayos homogéneos y en técnicas in situ (inmunocitoquímica, citometría de flujo), empezó a ser considerada como un sistema de detección muy sensible e incluso como una alternativa para reemplazar a los marcadores radiactivos en el campo de los inmunoensayos.
De hecho, la detección fluorométrica es una técnica extremadamente sensible, de manera que un compuesto fluorescente puede ser excitado más de 200.000 veces en un segundo y producir aproximadamente el mismo número de fotones emitidos. Sin embargo, los fluoroinmunoensayos de compuestos biológicos estuvieron durante mucho tiempo limitados por el background o fluorescencia residual producida por la unión no específica de los compuestos fluorescentes a determinados componentes del ensayo o el equipo, tales como los propios anticuerpos, plásticos, lentes, espejos...etc. Era evidente pues, que para que la fluorometría pudiera sustituir el contaje radiactivo, la señal específica tenía que ser separada de las interferencias de fondo o bien ser ampliada varios órdenes de magnitud.
Una de las alternativas más exitosas para solventar el problema fue el desarrollo de la fluorometría en tiempo retardado (TRF). En este sistema la señal se distingue del background residual por resolución temporal, es decir, la fluorescencia no es medida inmediatamente después de la excitación del compuesto fluorescente, sino que se deja pasar un cierto tiempo (400 microsegundos en el caso de compuestos marcados con europio) que permite excluir el background de corta duración...........
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